?青蒿

導(dǎo) 言：

自2015年青蒿素的研究獲諾貝爾獎(jiǎng)以來(lái)，各種媒體傳播低溫萃取青蒿素是科技創(chuàng)新，用乙醚低溫提取抗瘧有效成分是科學(xué)創(chuàng)新還是繼承?用沸點(diǎn)比乙醇低的乙醚提取青蒿是來(lái)源于東晉葛洪《肘后備急方》中的“青蒿一握，以水一升漬，絞取汁，盡服之”的啟示還是其他原因?本文作者將做較為詳盡的分析。

撰文 |曾美怡

責(zé)編 | 小 雨

2011年拉斯克臨床醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)和2015年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予屠呦呦個(gè)人，這是國(guó)際科學(xué)界對(duì)中國(guó)科學(xué)界在抗瘧藥青蒿素的成就給予的高度評(píng)價(jià)，是一種善意和尊重的表示。正因?yàn)檫@是科學(xué)獎(jiǎng)，我們就必須用客觀(guān)和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度為這個(gè)獎(jiǎng)項(xiàng)提供準(zhǔn)確的信息。但是無(wú)論是拉斯克獎(jiǎng)的獎(jiǎng)項(xiàng)說(shuō)明或是諾獎(jiǎng)推薦人蘇新專(zhuān)和米勒撰文闡述屠呦呦的貢獻(xiàn)時(shí)， 均提到是由于葛洪書(shū)中的“青蒿一握，以水二升漬，絞取汁，盡服之”的記載，使屠呦呦認(rèn)識(shí)到傳統(tǒng)的水煮或高溫提取會(huì)破壞有效成分，因而重新設(shè)計(jì)提取方法，用乙醚低溫提取，從而顯著提高了有效成分的穩(wěn)定性[1] [2]。

關(guān)于是低溫提取還是其他因素，黎潤(rùn)紅等的文中也曾提出過(guò)疑問(wèn)“到底是因?yàn)榭紤]到低溫還是因?yàn)榭紤]到親脂部位而改用乙醚提取，或是因?yàn)閺摹吨夂髠浼狈健分锌吹竭€是從“本草和民間”的“絞汁”得到啟發(fā)，現(xiàn)在無(wú)從定論”[3]，但是他們未做深入探討。

屠呦呦本人1972年3月8日在南京的匯報(bào)會(huì)上介紹這個(gè)經(jīng)驗(yàn)時(shí)說(shuō)，“從本草及民間‘絞汁’服用中得到啟發(fā)，使我們考慮到有效成分可能在親脂部分，于是改用乙醚提取，這樣動(dòng)物效價(jià)才有了顯著的提高”[4]。

這里姑且不說(shuō)“絞汁”是否可以理解為有效成分在親脂部分，但是用親脂性較強(qiáng)的乙醚代替乙醇是一種合理的選擇，其中也并沒(méi)有提到選擇乙醚是考慮到需要低溫提取。那么是誰(shuí)提出低溫提取的說(shuō)法呢?早在2009年，屠呦呦就在她的書(shū)中寫(xiě)道：在她看了東晉葛洪《肘后備急方》中將青蒿“絞汁”用藥的經(jīng)驗(yàn)，從“青蒿一握，以水一升漬，絞取汁，盡服之”截瘧，悟及可能有忌高溫或酶解等有關(guān)的思路，改用沸點(diǎn)比乙醇低的乙醚提取，并將該提取物分為中性和酸性?xún)刹糠郑?jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，才于1971年10月4日分離獲得的191號(hào)[5]。在2011年的《自然醫(yī)學(xué)》上屠呦呦再次發(fā)表文章，認(rèn)為從葛洪的《肘后備急方》中有關(guān)“青蒿一握，以水二升漬，絞取汁，盡服之”能緩解瘧疾的記載，想到過(guò)去采取常規(guī)的加熱提取可能破壞了有效成分，而低溫提取對(duì)保存其抗瘧有效成分是必須的[6]。從此，各種媒體也開(kāi)始傳播低溫萃取青蒿素是科技創(chuàng)新。2015年度科技創(chuàng)新人物中也說(shuō)屠呦呦以“創(chuàng)新性地使用了低溫萃取方法提煉出了可以治療瘧疾的青蒿素，這項(xiàng)研究是整個(gè)20世紀(jì)下半葉人類(lèi)偉大的醫(yī)學(xué)創(chuàng)舉之一，也是中國(guó)科學(xué)家對(duì)人類(lèi)的貢獻(xiàn)”。

首先應(yīng)該指出的是，1972年3月，屠呦呦得到的并非有效成分，而是有效乙醚中性提取物，是含有多種未知成分的混合物，需要進(jìn)一步從中分離出有效成分;其次，乙醇和乙醚都是分離提取天然化學(xué)成分常用的溶劑，只是乙醚的親脂性更強(qiáng)，沸點(diǎn)較低，經(jīng)過(guò)酸、堿處理也是一種常規(guī)提取流程，絕不是什么新發(fā)現(xiàn)，1972年報(bào)告中的說(shuō)法是可信的;其三，當(dāng)時(shí)對(duì)中藥青蒿的有效成分一無(wú)所知，所謂對(duì)熱穩(wěn)定或不穩(wěn)定只是一種猜測(cè)，更無(wú)從談到“創(chuàng)新”與否。

我們從以后全國(guó)各有關(guān)單位所采取的提取用溶劑看，云南藥物研究所用溶劑汽油(沸程88℃~120℃)常溫浸取，減壓回收(60℃~70℃)，50%乙醇溶液重結(jié)晶;山東中醫(yī)藥研究所用丙酮(沸點(diǎn)56℃)熱提或冷浸，減壓回收;四川省中藥研究所用稀醇法常溫浸取均獲得成功;說(shuō)明從青蒿中提取青蒿素可以采用的溶劑沸點(diǎn)范圍比較廣，減壓回收溶劑，青蒿素均未見(jiàn)被破壞。在諸多方法中，只有中藥研究所采取的乙醚提取法，由于乙醚的易燃易爆性質(zhì)，無(wú)法大規(guī)模提取。因此青蒿素必須低溫提取的說(shuō)法并無(wú)事實(shí)根據(jù)。

1973-1974年時(shí)，大家對(duì)青蒿素的化學(xué)結(jié)構(gòu)知之甚少，僅知其熔點(diǎn)約為156℃~157℃，但不清楚其分解溫度是多少。直至1975年上半年中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所在鷹爪甲素結(jié)構(gòu)的啟發(fā)下，證實(shí)了青蒿素分子結(jié)構(gòu)中的5個(gè)氧原子組成了除了一個(gè)內(nèi)酯環(huán)之外，還含有一個(gè)過(guò)氧橋[7]。1975年11月，中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所用X射線(xiàn)單晶衍射方法確證了青蒿素的初始的晶體和分子立體結(jié)構(gòu)，1977年底最后成功地用X射線(xiàn)反常散射，確證其絕對(duì)構(gòu)型[8];中國(guó)科學(xué)院上海藥物所又證實(shí)了這個(gè)過(guò)氧橋是青蒿素抗瘧作用的關(guān)鍵[7]，人們才開(kāi)始思考，青蒿素作為一個(gè)有機(jī)過(guò)氧化合物，按照過(guò)氧化合物的特性，青蒿素應(yīng)該是不穩(wěn)定的，但是種種試驗(yàn)表明青蒿素是一個(gè)對(duì)光和熱都比較穩(wěn)定的化合物。

1979年中科院生物物理所就已經(jīng)指出，“青蒿素分子中五個(gè)氧原子都集中在分子的一側(cè)， 且從O5起有一條碳氧鏈O5―C12―O4―C7―O3― C8―O1―O2―C6，其中碳氧鍵長(zhǎng)自C12―O4起順序以短、長(zhǎng)、短、長(zhǎng)、短的方式連接起來(lái)， 而且都介于正常單鍵和具有部分雙鍵鍵長(zhǎng)之間。由于每個(gè)氧原子上都有孤對(duì)電子， 可能每個(gè)氧原子上的孤對(duì)電子已不局限于氧原子上， 而發(fā)生了鍵型的變異， 這有助于使整個(gè)分子趨于穩(wěn)定， 這與青蒿素分子或晶體表現(xiàn)出對(duì)熱和光照的穩(wěn)定性相吻合。而這一條碳氧鏈， 可能就是青蒿素分子有著特定效能的部位”[8]。

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所梁曉天認(rèn)為，雖然青蒿素對(duì)強(qiáng)酸、強(qiáng)堿不穩(wěn)定，但是青蒿素在中性非極性溶劑中保持穩(wěn)定的溫度至少可達(dá)150℃[9]。中藥研究所化學(xué)室羅宣德和美國(guó)全國(guó)衛(wèi)生研究所(NIH)的同行將青蒿素在不同沸點(diǎn)的溶劑中加熱，結(jié)果證明，青蒿素在乙醇(注：沸點(diǎn)78.4℃)中回流2天，或在甲苯(注：沸點(diǎn) 110.5 ℃)中回流4天，經(jīng)薄層層析檢查，香蘭醛顯色，仍未見(jiàn)有分解產(chǎn)物[10]。1985年美國(guó)華爾特里德陸軍研究院(Walter Reed Army Institute of Research)的Lin AJ，和Klayman DL等研究青蒿素分子的熱重排和熱分解，認(rèn)為青蒿素純品可耐受200℃ 高溫2.5min， 如超過(guò)3.5min或在190℃ 下保持10min則會(huì)發(fā)生變化[11]。因此，青蒿素相較一般過(guò)氧化物而言，其熱穩(wěn)定性是超乎尋常的。

2007年武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院董家新等用絕熱量熱法測(cè)定青蒿素晶體在80K 至363K低溫范圍的克分子熱容和熱穩(wěn)定性。作者以熱重量?jī)x-紅外光譜聯(lián)用，測(cè)定青蒿素的熱變化，從差熱分析曲線(xiàn)觀(guān)察到青蒿素的兩步熱變化主要在420至620K之間，吸熱峰和青蒿素熔融同時(shí)發(fā)生在420K，放熱峰發(fā)生在緊接吸熱峰之后，分子重排及分解同時(shí)發(fā)生在480K[12]，顯示青蒿素在熔融時(shí)還未發(fā)生分解，但是二者的吸熱峰和放熱峰非常接近。

2014年南京理工大學(xué)高海素用差示掃描量熱儀，分別研究了青蒿素及其衍生物青蒿琥酯、蒿甲醚和雙氫青蒿素-1*在線(xiàn)性升溫條件下，青蒿素的熔化溫度最高，發(fā)生熱分解失控的可能性最小。在等溫條件下，青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚和雙氫青蒿素的熱分解反應(yīng)屬于自加速分解，其自加速分解溫度(SADT值)分別為95℃、77℃、78℃和 58℃， 其中，雙氫青蒿素-1*的熱危險(xiǎn)性最高[13]。

早在1970年屠呦呦的組員余亞綱及軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院顧國(guó)明和焦岫卿就已經(jīng)證明，用北京中藥青蒿市售品的乙醇提取物，對(duì)鼠瘧的抑制率為60~80%(顧國(guó)明提供)或90%以上(焦岫卿提供)[7]。1972年3月屠呦呦報(bào)告認(rèn)為，必須將乙醇提取改為乙醚提取，其實(shí)關(guān)鍵不在乙醇，也不是必須低溫提取， 關(guān)鍵在所用的藥材來(lái)源。他們所采用的北京的市售青蒿都是藥材公司從當(dāng)?shù)厥召?gòu)的野生植物黃花蒿，能否從這些干燥的藥材分離到有效部位取決于藥材的植物品種、生長(zhǎng)環(huán)境、采收時(shí)間和采集部位(花、葉、莖)。后來(lái)的研究證實(shí)，迄今為止，只有菊科植物黃花蒿(Artemisia annua L。)或大頭黃花蒿(Artemisia annua L。 f macrocephala Pamp。)含有青蒿素這種抗瘧活性成分;青蒿素在植物的花含苞欲放時(shí)，在葉子中的含量最高，隨著花開(kāi)后，葉子中的含量就迅速下降，此時(shí)花中的含量比葉中最高含量還要高，青蒿素積聚的高峰期也不過(guò)1周左右。

從生長(zhǎng)地區(qū)來(lái)看，北京植物黃花蒿的青蒿素含量比南方草低得多，相對(duì)雜質(zhì)就更多，分離提取的難度比較大，這就是當(dāng)年中藥所面臨的問(wèn)題。四川、海南生長(zhǎng)的黃花蒿中有效成分含量高，雜質(zhì)相對(duì)就較少，分離提純就比較容易。因此，北京產(chǎn)的黃花蒿的質(zhì)量差，就是當(dāng)年中藥所重復(fù)用乙醚提取青蒿素屢屢失敗的原因之一。后經(jīng)測(cè)定北京產(chǎn)的鮮活的黃花蒿，其中的青蒿素含量大大低于海南。這些影響因素是直到1977年建立了測(cè)定方法的靈敏度達(dá)到微克/毫升，才能準(zhǔn)確地回答這些問(wèn)題。下表是作者1978年在中藥研究所生藥研究室工作時(shí)，比較影響植物黃花蒿中青蒿素含量的諸因素所得的數(shù)據(jù)。提取所用的溶劑以石油醚(60℃~90℃)最佳，含量測(cè)定方法為薄層層析-紫外分光光度法。青蒿素平均回收率為94.2%[14]。

作者1976年受中藥研究所領(lǐng)導(dǎo)指派，籌建青蒿質(zhì)量組，1977年參與全國(guó)青蒿素含量測(cè)定和質(zhì)量研究，1978年負(fù)責(zé)和技術(shù)員付桂蘭共同完成此課題，并存檔，論文則以生藥研究室名義，被收集在中藥所專(zhuān)輯[14]。屠呦呦在她的書(shū)中將此項(xiàng)研究據(jù)為己有，引用本表時(shí)未經(jīng)作者同意，更未注明來(lái)源，還刪去表中的工作年份(1978)和海南島的全部數(shù)據(jù)[14]。

應(yīng)該說(shuō)，早期對(duì)青蒿素一無(wú)所知的情況下，屠呦呦1972年3月在會(huì)上報(bào)告試探用親脂性較高的乙醚提取代替乙醇得到中性有效部分，證實(shí)其對(duì)鼠瘧抑制有效，對(duì)以后的深入研究起到推動(dòng)的作用，是應(yīng)該肯定的，也是符合分離提取天然化合物的常規(guī)操作，但和葛洪的“絞汁服”并無(wú)關(guān)系，無(wú)非是表示“繼承”了古代中醫(yī)典籍的說(shuō)法而已。后來(lái)卻又不斷強(qiáng)調(diào)提出用乙醚是低溫提取是發(fā)現(xiàn)青蒿素的關(guān)鍵性突破。

經(jīng)過(guò)將近40年的科研實(shí)踐和對(duì)其特殊化學(xué)結(jié)構(gòu)的破解，說(shuō)明青蒿素和一般有機(jī)過(guò)氧化物相比，對(duì)熱比較穩(wěn)定是得益于其令人嘆為觀(guān)止的特殊化學(xué)結(jié)構(gòu)。因而青蒿素?zé)o需低溫提取，乙醚更不是必須的溶劑，也不適用于工業(yè)化生產(chǎn)。但是到2015年屠呦呦在諾貝爾獎(jiǎng)?lì)C獎(jiǎng)會(huì)演講時(shí)，還認(rèn)為是由于改進(jìn)了用乙醚低溫提取，得到有效中性部分這個(gè)突破性發(fā)現(xiàn)，成為發(fā)現(xiàn)青蒿素的關(guān)鍵性一步[15]。這種堅(jiān)持青蒿素低溫提取突破的說(shuō)法就有違科學(xué)實(shí)踐，至今不予糾正，是不應(yīng)該的。而蘇新專(zhuān)和米勒所謂低溫提取法“提高了其活性成分的穩(wěn)定性”則更是無(wú)稽之談了。

作者退休前為中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所分析化學(xué)室研究員，1990年退休后，受聘于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院五所任客座教授。本文涉及到的專(zhuān)業(yè)問(wèn)題較多，作者未必都能說(shuō)清楚，如有錯(cuò)誤之處，歡迎指正。

本文原載《科學(xué)春秋》，《知識(shí)分子》獲授權(quán)刊發(fā)。

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